大豆多肽屬于生物活性肽，是以大豆蛋白為主要原料兆婆，經(jīng)過(guò)提取分離植嚼、純化并精制而成的低聚肽的混合物(蛋白質(zhì)水解物)，通常以由 3～6個(gè)氨基酸組成的小分子肽為主婿哥，還含有少量游離氨基酸钾非、糖類、水分和無(wú)機(jī)鹽等酣矮。大豆多肽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值巨均，其氨基酸組成與大豆蛋白完全一樣，是一種理想的新型大豆深加工產(chǎn)品【1】颅挟。
大豆蛋白經(jīng)酶水解后测捎，其產(chǎn)物中含有多種生理活性肽小分子大豆肽不僅溶解性好弓洒、黏度低，而且在人體內(nèi)消化吸收快律罢。另外膀值，還具有降血壓、降血脂误辑、降膽固醇沧踏、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、脂肪代謝巾钉、免疫調(diào)節(jié)翘狱、抗氧化、抗癌砰苍、抗輻射盒蟆、減肥、調(diào)節(jié)血糖濃度师骗、抗疲勞历等、低過(guò)敏性、促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝等多種不同的生物活性【2】辟癌。
大豆蛋白酶水解產(chǎn)物在食品工業(yè)中一般應(yīng)用于飲料寒屯、奶粉奶酪乳制品和代乳品中，也可添加在肉類食品和醋滩哥、醬油等發(fā)酵食品中下桃，可以用來(lái)生產(chǎn)面條、饅頭溃恼、面包以及冷凍食品. 以顯著提高產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值磅愤，并增強(qiáng)產(chǎn)品的口感風(fēng)味【1】【2】。
《GB/T 22492-2008 大豆肽粉》為生產(chǎn)企業(yè)提供一個(gè)通用的產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)范追粉，但對(duì)于大豆肽粉在大豆蛋白提取举库、酶解、發(fā)酵短硼、肽的過(guò)膜分離(超濾翩性、微濾、納濾)自幕、色譜分離(液相稽徙、GPC)、脫色振袋、脫苦等工藝控制環(huán)節(jié)沒(méi)有指導(dǎo)方法很鸥。
本文探索了豆粕蛋白酶解粗肽的反相液相色譜分析方法，操作簡(jiǎn)便珍语，通用性好锤岸，適用于質(zhì)控環(huán)節(jié)竖幔，為液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)序提供了先導(dǎo)方法。
2能耻、樣品前處理
2.1 試劑配制
流動(dòng)相：取3mL色譜級(jí)甲酸加入1L色譜級(jí)乙腈中，無(wú)需抽濾亡驰，混勻超聲10min晓猛；取3mL色譜級(jí)甲酸加入1L超純水中，無(wú)需抽濾凡辱，混勻超聲10min戒职。
2.2 試劑配制
樣品配制：樣品為豆粕蛋白的酶解產(chǎn)物，未經(jīng)過(guò)膜處理透乾，多肽分子量分布很廣的粗品洪燥。分別稱取大豆肽1號(hào)2號(hào)3號(hào)試樣各20mg于三個(gè)2ml液相小瓶中，各加超純水1ml乳乌，渦旋1min捧韵，用0.22um尼龍66濾頭過(guò)濾，待用赴碘。
3社衰、色譜條件
3.1 儀器信息
儀器硬件：ThermoFisher Vanquish液相色譜儀
色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3.1；中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件
3.2 方法信息
色譜柱：Accucore Vanquish C18 2.1 mm×150 mm鸡视，1.5 μm(PN：27101-152130)
流動(dòng)相：A：0.3%甲酸水溶液桃旷；B：0.3%甲酸乙腈溶液，
流速：0.2 mL/min酒半，梯度程序見(jiàn)表1：
表1. 梯度洗脫程序
進(jìn)樣量：2 µL
柱溫：30℃(still air模式)
檢測(cè)器波長(zhǎng)：280nm
4薯舆、樣品分析譜圖及測(cè)定結(jié)果
4.1 典型色譜圖
圖1a. 大豆肽1號(hào)樣品和空白色譜圖疊圖
圖1b. 大豆肽1號(hào)224nm、280nm色譜圖及光譜信息
4.2 重復(fù)性
圖2. 大豆肽3號(hào)樣品六針連續(xù)進(jìn)樣色譜晨下、壓力疊圖
表2. 大豆肽3號(hào)樣品六針連續(xù)進(jìn)樣保留時(shí)間和峰面積穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
4.3 相似度評(píng)價(jià)
借助中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件累冠，可以比較兩個(gè)譜圖之間的差異，進(jìn)而了解來(lái)料大豆肽的批次間差異拳芹，為指導(dǎo)工藝調(diào)整提供科學(xué)直觀依據(jù)示谐。
圖3. 大豆肽1號(hào)、2號(hào)势送、3號(hào)指紋圖譜和相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
● 積分參數(shù)平滑為0.4拔调，即加大平滑令色譜峰以峰組形式存在，數(shù)目相對(duì)減少時(shí)猜谚，以大豆肽3號(hào)為對(duì)照時(shí)败砂，大豆肽1號(hào)的相似度為0.663，大豆肽2號(hào)的相似度為0.7魏铅。
● 針對(duì)復(fù)雜樣品昌犹，以峰組形式積分(結(jié)合平滑等參數(shù))坚芜，可以得到數(shù)目合適，又能覆蓋主要色譜峰的積分譜圖斜姥『枋基于此的評(píng)價(jià)結(jié)果才更為合理。
結(jié)果與討論
1铸敏、客戶樣品為豆粕蛋白酶解產(chǎn)物缚忧，未經(jīng)過(guò)膜分離，多肽分子量分布跨度大杈笔，同時(shí)不排除混有糖闪水、蛋白、氨基酸等其他化合物蒙具。若能將樣品通過(guò)超濾膜分離凈化嬉哥，按照分子量范圍分成幾組肽段，分別建立液相方法勒蜀，則借助液相做質(zhì)控更科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)一些津咒。
2、樣品前處理少雁碘，優(yōu)勢(shì)在于快捷高效伞买，成本低，適于工廠化驗(yàn)室操作驴涡，對(duì)人員要求不高肯坊。劣勢(shì)在于樣品基質(zhì)復(fù)雜、粗肽組份繁雜觅符，對(duì)液相的穩(wěn)定性要求非常高诉拔。峰組ABCD的保留時(shí)間穩(wěn)定性在1%以內(nèi)、峰面積重現(xiàn)性在2%以內(nèi)深吠。每組六針進(jìn)樣壓力曲線都非常平穩(wěn)波動(dòng)僅在0.4 bar增厢，該方法穩(wěn)定性非常好。
3桑孩、創(chuàng)造性的首次將粗肽分析與中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件相結(jié)合拜鹤，可以從整體分析、在宏觀上了解粗肽批次間的差異流椒；憑借Vanquish液相卓越的穩(wěn)定性敏簿，在變色龍軟件里平行比較兩批次樣品譜圖的細(xì)節(jié)差異。進(jìn)而從宏觀和微觀兩方面入手宣虾，在調(diào)控酶解惯裕、過(guò)膜超濾、GPC分離等工藝環(huán)節(jié)中發(fā)揮指導(dǎo)作用绣硝。解決粗肽可視化直觀化的質(zhì)控問(wèn)題蜻势。
4撑刺、做相似度評(píng)價(jià)時(shí)，建議選取成熟穩(wěn)定粗肽樣品中主要成分色譜峰或峰組作為評(píng)價(jià)標(biāo)的握玛。積分時(shí)通過(guò)加大平滑將色譜峰以峰組的形式積分够傍，即簡(jiǎn)化譜圖，又可提升譜圖間可比性挠铲。通常相似度0.9以上認(rèn)為批次間是穩(wěn)定一致的冕屯。解決粗肽質(zhì)控評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立問(wèn)題。
5檐射、從向食品中添加大豆肽铜那，以提升食品(代乳制品崔捌、醬油洪防、面食等)營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)角度來(lái)說(shuō)，本法做來(lái)料質(zhì)控基本可行榄陆。從向食品中添加活性肽沛摩，打造功能性保健食品角度來(lái)說(shuō)，還需進(jìn)一步對(duì)來(lái)料做超濾膜分離剧债，得到5000Da以下的肽帽遏，本法為MS友好流動(dòng)相可以直接結(jié)合高分辨質(zhì)譜找到有價(jià)值的活性肽。從科研角度來(lái)說(shuō)昏锨，本法基礎(chǔ)上擴(kuò)展CAD電霧式檢測(cè)器祷鼎，可以檢測(cè)無(wú)紫外吸收和弱紫外吸收的物質(zhì)，如氨基酸度坞、GABA(伽馬氨基丁酸)映僚、單糖多糖等。
6点骑、客戶要求用Accucore 1.5 μm的色譜柱開(kāi)發(fā)該方法酣难，以期面對(duì)極其復(fù)雜樣品時(shí)，能得到較好分離度黑滴，考慮到樣品和基質(zhì)實(shí)際情況憨募，推薦客戶試用Hypersil GOLD Peptide 1.9um，175Å色譜柱兩根串聯(lián)使用提高復(fù)雜樣品分離能力袁辈，賽默飛還有其他適合分析多肽的色譜柱菜谣，如Accucore 150 C4，Acclaim 300 C18晚缩，BioBasic 300Å等葛菇。
7、該方法操作簡(jiǎn)單僅需過(guò)濾樣品即可橡羞，是降本又增效的液相色譜分析方案眯停，將會(huì)對(duì)食品工業(yè)中添加粗肽济舆、大豆肽的企業(yè)提高品控水平。
8莺债、本文為探索性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)滋觉。為解決粗肽、大豆肽生產(chǎn)過(guò)程中部分質(zhì)控問(wèn)題讼石，提出跨界解決問(wèn)題的思路苇赊，若能結(jié)合GPC做分子量分布研究，將其整合為一套完整方案回乞，則產(chǎn)品質(zhì)控會(huì)更加全面嚴(yán)謹(jǐn)忠辛，終將有利于生成企業(yè)、消費(fèi)者和監(jiān)管部門夹恨。
合作伙伴
李丹課題組：李丹哎闻，男，生于1972年10月闰芒；江南大學(xué)食品科學(xué)博士枚林、韓國(guó)國(guó)立首爾大學(xué) (Seoul National University) 食品科學(xué)與生物技術(shù)系博士后、美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué) (University of Florida) 微生物與細(xì)胞科學(xué)系訪問(wèn)學(xué)者墓运；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才郭菜；吉林省二級(jí)教授，吉林省有突出貢獻(xiàn)的中青年專業(yè)技術(shù)人才鞍歌，吉林省拔尖創(chuàng)新人才二層次】彼牛現(xiàn)任長(zhǎng)春大學(xué)“大豆生物加工技術(shù)吉林省發(fā)改委工程實(shí)驗(yàn)室”主任、“農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”主任褂删。主要從事食品科學(xué)與農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域的教學(xué)與科研工作飞醉。主持完成國(guó)家自然科學(xué)基金“面上項(xiàng)目”2項(xiàng)，主持完成科技部“國(guó)際科技合作項(xiàng)目”1項(xiàng)笤妙，主持完成“教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”和“教育部留學(xué)回國(guó)人員科研基金”項(xiàng)目2項(xiàng)冒掌，主持完成省市廳級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目11項(xiàng)；在本學(xué)科國(guó)際著名SCI期刊蹲盘，發(fā)表英文論文50余篇股毫，其中在中科院學(xué)術(shù)期刊分區(qū)一區(qū)期刊發(fā)表論文18篇；獲得授權(quán)發(fā)明專利6件召衔，獲得英國(guó)Elsevier最多引用論文獎(jiǎng)铃诬、吉林省科技廳吉林省科技獎(jiǎng)自然科學(xué)獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)等省部級(jí)科研成果獎(jiǎng)勵(lì)9項(xiàng)。
參考文獻(xiàn)：
【1】大豆多肽的研究進(jìn)展 高蕾蕾苍凛，李迎秋2018 年第 2 期 江蘇調(diào)味副食品 總第 153 期 *? DOI: 10. 16782 /j. cnki. 32-1235 /ts. 2018. 02. 002
【2】大豆蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)面粉糊化特性的影響崔會(huì)娟趣席，王璐，郭興鳳 *河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition) 第 36 卷第 1 期 2015 年 2 月
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