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 為活細(xì)胞研究設(shè)計光學(xué)顯微系統(tǒng)時，首要考慮的是檢測器的敏感度（對信號乃至噪音的檢測）花鹅，圖像獲取的速度氧腰，以及在此基礎(chǔ)上標(biāo)本的可行性。對于固定細(xì)胞的成像呐缸，曝光時間及光強(qiáng)度相對來說都很高，這時可能會造成光漂白尼缨；然而對于活細(xì)胞成像疫谱，上述光的影響必須去除。幾乎在所有情況下综货，活細(xì)胞顯微鏡都會在盡可能高的圖像質(zhì)量與盡可能好的細(xì)胞活性之間取得一個平衡嚣惭。對于此類實驗，時間及空間上的分辨率需要設(shè)定在能滿足實驗要求的水平上螃势，而不是給予過度的光照或設(shè)定過多采樣時間點罕擒。

 

 

 

基本上,一個理想的活細(xì)胞成像系統(tǒng)必需有足夠的敏感度，來滿足在弱熒光條件下仍能得到高圖片質(zhì)量；同時氧液，系統(tǒng)也必需足夠快跟媚，以記錄整個動態(tài)過程。 另外沧仿，這個系統(tǒng)還需要有足夠高的分辨率以捕捉樣品細(xì)節(jié)箍秧，并且能夠準(zhǔn)確的實時測量每個微小的光強(qiáng)變化。然而不幸的是馁筐，要改善上述的任意一條都需建立在犧牲其它性能的基礎(chǔ)上涂召。因此現(xiàn)在還不能夠設(shè)計出一個可以滿足所有要求的活細(xì)胞成像體系。研究人員現(xiàn)在只能在盡量減低不重要的信息的遺失的同時敏沉，盡可能的獲得zui優(yōu)的重要參數(shù)果正。這樣，顯微鏡的配置zui終取決于成像的要求盟迟，對于樣品在實驗期間活性的要求秋泳，進(jìn)行標(biāo)記的難度水平，以及儀器的可用性等實際因素队萤。

如圖一（Figure 1）所示為一臺倒置研究級顯微鏡轮锥，它配有四個相機(jī)接口，并可滿足對培養(yǎng)的組織的研究要尔。在四個接口上分別配有四個不同的相機(jī)舍杜，每一個都用來獲取不同的圖像。在大多數(shù)情況下赵辕，這種顯微鏡的分光設(shè)計是100％進(jìn)入相機(jī)或以80：20的比例同時分配給相機(jī)和目鏡既绩。在弱光成像時，研究人員必需確保將zui敏感的相機(jī)接在100％分光口上膘掀。在圖一中殿腺，彩色CCD（Full color CCD）接在顯微鏡的底部（a），它從物鏡接受的光信號不經(jīng)過棱鏡或反光鏡的反射既倾。這樣的相機(jī)通常用來進(jìn)行多色熒光或明場拍攝瓮窑。顯微鏡右側(cè)連接的電子倍增電荷偶聯(lián)設(shè)備（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b）队屋，它通常用來檢測極弱的熒光信號拱屈。接在顯微鏡左側(cè)的相機(jī)（c）配有一個高量子效應(yīng)的感應(yīng)器，可以感應(yīng)700－1000nm 波長范圍內(nèi)的光卵手，所以這個相機(jī)可以用來進(jìn)行微分干涉相稱（differential interference contrast鸦贩，DIC）觀察方法下厚標(biāo)本的紅外線照明成像。zui后诫列，對于高分辨率的單色熒光成像垄怯，如全內(nèi)反射熒光或其它熒光技術(shù)水水，圖一中的顯微鏡在前部（d）配備了Peltier-cool 相機(jī)。這個相機(jī)zui小像素點為6μm迂卢，適合于此類成像的需求某弦。如圖一中的配置非常昂貴，但是它能滿足用戶所有的成像要求冷守。

進(jìn)行活細(xì)胞成像的光學(xué)顯微鏡需要寬光譜增稱模塊刀崖。大多數(shù)的研究者使用熒光顯微鏡，通常還會配合一種或多種透射光技術(shù)拍摇。其中熒光技術(shù)包括了傳統(tǒng)的寬視場落射熒光亮钦，激光掃描共聚焦，真空碟片共聚焦充活，場掃描共聚焦蜂莉，多光子，全內(nèi)反射（TIRF）混卵，熒光關(guān)聯(lián)光譜映穗，熒光壽命成像（FILM），光活化幕随，鐳射陷阱等技術(shù)蚁滋。相應(yīng)的成像技術(shù)有光譜成像，多色成像赘淮，共定位泵李，時間序列，熒光光漂白恢復(fù)腔族，（FRAP虑夕，FLIP，FLAP）羽折，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）沼改，熒光散斑顯微鏡，膜片鉗技術(shù)等巍樟，以上這些技術(shù)通常要配合一種或多種基礎(chǔ)成像技術(shù)经翻。當(dāng)熒光與明場,DIC,霍夫曼調(diào)制相稱（HMC）,相差等技術(shù)相結(jié)合時,熒光技術(shù)作為探針,可用于定位.對于絕大多數(shù)的活細(xì)胞成像來說,顯微鏡的配置都需要滿足一些特定的需要以保證試驗能夠成功進(jìn)行。除了顯微鏡與數(shù)字成像系統(tǒng)捍幽，活細(xì)胞成像還需要考慮到兩個限制因素——一個是保持細(xì)胞的活性芋总，另一個是在北京噪音及自發(fā)熒光的基礎(chǔ)上盡可能的提高信號強(qiáng)度。

提高活細(xì)胞成像的信噪比

活細(xì)胞成像與固定細(xì)胞成像之間的基本區(qū)別是兆性，后者的成像沒有過多的限制， 如合適視野的選定泳柴，曝光時間的設(shè)定赋荆，電子益增的設(shè)定笋妥，讀出率及,偏移值等。這樣窄潭，染色的固定樣品的成像就可以充分利用相機(jī)的全部動態(tài)設(shè)定春宣。因此，固定成像可以得到理想的信噪比嫉你。但不幸的是月帝，由于細(xì)胞活性對照明的嚴(yán)格要求，活細(xì)胞成像的情況又與固定細(xì)胞的成像有所不同幽污。在活細(xì)胞成像時嚷辅，樣品的灰度往往比背景高不了多少。在這種情況下距误，成像首要考慮的是檢測系統(tǒng)的暗電流及噪音值簸搞。經(jīng)濟(jì)型的相機(jī)通常噪音都會比較高，導(dǎo)致背景混亂并掩蓋樣品信號准潭，在讀出速率增加時這種影響更為嚴(yán)重趁俊。所以，幾乎所有的活細(xì)胞成像設(shè)備質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)都是檢測器的好壞完骑。

數(shù)字圖像的噪音主要由四方面造成剩跛，檢測器，照明系統(tǒng)谢佩，Poisson 噪音或shot 噪音（由于光子通量的隨機(jī)性造成）优狡，以及彌散光。在大多數(shù)情況下休贴，通過選擇好的檢測器或優(yōu)化照明條件可以降低系統(tǒng)噪音角涯。事實上，任何一種光子檢測器在記錄的時候都會產(chǎn)生某種形式上的噪音钥陪。掃描光聚焦及多光子顯微鏡中的光電倍增管（PMT）會產(chǎn)生雜電子腻区。同樣的，用于明場螟扮，全內(nèi)反射份良，針孔碟片共聚焦，場掃描顯微鏡的CCD也會生成背景暗電流骏挎。對此汗忠，CCD 及光電倍增設(shè)備也做了一系列的改進(jìn)，比如制冷設(shè)備兜叨，它會使儀器工作時保持在低溫狀態(tài)穿扳，從而降低暗電流的水平。然而国旷，在讀取光信號并將模擬信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號的時候矛物，特別是CCD這種儀器茫死，也會產(chǎn)生噪音，即read noise履羞，制冷數(shù)碼相機(jī)產(chǎn)生的主要噪音峦萎。

                                                                       

                             

Figure 2所示為影響活細(xì)胞成像質(zhì)量的數(shù)字相機(jī)的讀出速度與敏感度的相互依存關(guān)系。The specimen is a culture of human 圖中樣品為人的宮頸癌細(xì)胞（HeLa 細(xì)胞系）忆首，展示mKO（monomeric Kusabira Orange）熒光蛋白與人的α珠蛋白融合爱榔，圖片在寬視場熒光下單色相機(jī)拍攝，照明中添加TRITC濾片糙及，讀出速度為10或1.25 MHz详幽。Figures 2（a） & 2（b）所示，在關(guān)閉CCD 光閘的條件下丁鹉，低讀出速度下的噪音要明顯高于高讀出速度下的噪音妒潭。但是，如果將CCD 調(diào)節(jié)到全動態(tài)范圍的話榆博，這方面的 影響就不明顯了仲及，如Figures 2（c） & 2（d） 所示；然而侧焚，在低光照條件下锭偿，低讀出速度（Figure 2（f））的圖片質(zhì)量要明顯的優(yōu)于高讀出速度（Figure 2（e）。 Figures 2（e） & 2（f） 的照明強(qiáng)度大約是 Figures 2（c） & 2（d） 的十分之一摆地。如將照明強(qiáng)度再降低5倍效果會更加明顯挂剪，如Figures 2（g） & 2（h），低讀出速度下的圖片至少還能夠表達(dá)出需要的效果（Figure 2（h））增量，然而高讀出速度下的成像質(zhì)量則很不理想（Figure 2（g））她打。

一個成功的數(shù)字成像實驗，要求樣品的空間照明模式是連續(xù)的童唧，即整個視野內(nèi)的照明是連續(xù)一致的栽埠，每次成像間的圖片也是連續(xù)一致的。這取決于照明光源镐胃，使用鎢鹵素?zé)粽彰鳎?/span>樣品的光學(xué)性質(zhì)在顯微鏡下通常都是連續(xù)的（被稱為光學(xué)一致性）镶骗。然而使用激光掃描顯微鏡的照明裝置對某一特定的點進(jìn)行掃描，則每一次的掃描結(jié)果都不一樣躲雅。另外鼎姊，使用汞燈（the mercury plasma arc-discharge lamp）作為寬視野熒光顯微鏡的照明光源，圖片結(jié)果會在光譜上體現(xiàn)為特定的分離的波長峰值相赁。相比之下氙燈（Xenon lamps）在可見光譜下的結(jié)果就相當(dāng)連續(xù)相寇，÷但是在它在紫外區(qū)的結(jié)果不佳（這一光譜范圍通常不用于活細(xì)胞成像）。

對于金屬鹵素?zé)?/span>這樣的照明光源钮科，它的特性介于汞燈與氙燈之間裆赵，也許是性能*的光源东囚。金屬鹵素?zé)裟?/span>夠提供從紫外到紅外間連續(xù)的光譜，此外战授，保有汞燈的光強(qiáng)。除了調(diào)整照明光源桨嫁，為了達(dá)到照明一致的效果植兰，還可以在燈箱及顯微鏡的照明輸入端口之間添加一個光導(dǎo)纖維（或液體光導(dǎo)）。在視場中的照明梯度可以通過計算來矯正（flat-field algorithms）璃吧。燈泡有時在輸出的亮度會與平均值有10％的偏離据篇，這時需要注意的是它不能夠通過光學(xué)纖維來矯正超棚，而要使用穩(wěn)定的電源。

對光子通量的測量是統(tǒng)計學(xué)的處理，在檢測信號時會產(chǎn)生偏差勺处。所謂的Poisson 或 shot noise（如前所述），它體現(xiàn)在測量N個光子時晨偿，出現(xiàn)的偏差與N的平方根成正比景捅，即信噪比。所以笋窍，增加信號光子的數(shù)量N可直接提高信噪比及圖像對比度流肢。提高信號zui簡單的方法是手機(jī)更多的光子，通常做法是增加曝光時間或提高激發(fā)照明的強(qiáng)度项凉，但是這些做法會增加光毒性并降低細(xì)胞活性期位。其次，另一個更有用的方法是加強(qiáng)檢測器的敏感度巧糖。

為了解決活細(xì)胞成像低光照的問題剩膏，現(xiàn)在的數(shù)字CCD 相機(jī)檢測器更加敏感，這是通過面元劃分（binning）來實現(xiàn)的（如Figures 3 & 8所示）蜻蒋。一般CCD讀取像素點會將橫向上的像素值轉(zhuǎn)移到只讀寄存器上砂豌，然后進(jìn)行順序分析。在binning 處理時啥刻，相互臨近的一群光信號會被合在一起檢測（2 x 2 或 4 x 4）為一個信號值進(jìn)行輸出奸鸯。這通過將多行像素轉(zhuǎn)移到一系列只讀寄存器（比如兩行進(jìn)行 2 x 2 binning ，四行進(jìn)行4 x 4 binning）中然后多行同時讀取來實現(xiàn)的可帽。在2 x 2 binning 情況下娄涩，空間分辨率會降低一半，信號強(qiáng)度增加4倍映跟，信噪比增加2倍蓄拣。很明顯，雖然降低了空間分辨率努隙，但對于弱信號強(qiáng)度的提高是很顯著的球恤。

 

 

 

Figure 3顯示的是將臨近的像素結(jié)合在一起并不斷的增加binning 水平辜昵，對數(shù)字圖像的空間分辨率及zui終尺寸的影響。樣品為印度麂鹿皮膚組織的纖維原細(xì)胞咽斧，它表達(dá)mCherry 熒光蛋白（紅色偽彩）及人的β肌動蛋白堪置，位于應(yīng)力纖維組成的絲狀細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)中。通常在進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記時糯锦，表現(xiàn)出很好的共定位的細(xì)胞常常表達(dá)很低水平的融合蛋白攒陋，其發(fā)出的信號極微弱。如果不用binning處理（Figure 3（a））值膝，在不產(chǎn)生光毒性及光漂白的曝光時間下得到的信號弱到無法辨別筒煌。Binning 2 x 2 漸進(jìn)到 4 x 4增加了信號水平，但降低了空間分辨率（Figures 3（b） and 3（c））欺垛。在binning 8 x 8 像素下的圖像（Figure 3（d））zui亮拱宗。但分辨率降低極多。另外很重的一點是隆鹤，在binning 處理時菜盒，增加合并像素點，圖像尺寸按比例縮小例如聪痢，不進(jìn)行binning 處理（1 x 1）的圖像（Figure 3）的原始大小為1360 x 1024 （pixels）赶馍，在（2 x 2）, （4 x 4）, 及 （8 x 8） 處理條件下的圖像分辨率分別為680 x 512, 340 x 256, 及 170 x 128 （pixels）。如上所述翼袒，這些圖像的尺寸被縮小了摘甜。同樣的，一個512 x 512 的數(shù)碼相機(jī)在進(jìn)行上述比例處理時玄柏，圖像的大小將分別縮小為256 x 256, 128 x 128, and 64 x 64 （pixels）襟衰。

Binning 處理的重點是讀出噪音產(chǎn)生在binning 處理后，所以雖然讀取了幾個像素的集合粪摘，但是每個binning處理后的像素只讀取一次瀑晒。相對的，像 2 x 2 這樣的像素集合徘意，如果先收集信號再進(jìn)行平均計算苔悦，那么由于每個點都會產(chǎn)生噪音，這樣的結(jié)果會比binning差椎咧。因此玖详，雖然binning處理會降低空間分辨率，但是這樣的處理可以顯著提高空間分辨率勤讽，這在光敏細(xì)胞的試驗中是非常有意義的蟋座，因為在這樣的試驗中，光照水平非常的低，而且曝光時間和很短向臀。在活細(xì)胞成像中zui重要的參數(shù)通常是檢測若熒光信號的能力巢墅，而不是空間分辨率，所以隆文，通過binning 處理提高敏感度及縮短曝光時間是成像的重點美卒，不需太多考慮空間分辨率。除binning 處理外症妻，許多相機(jī)通過小范圍拍攝或只拍攝感性的區(qū)域來縮短曝光時間节婶，這種拍攝方法可以在保有空間分辨率的同時減少曝光對細(xì)胞的損害。

克服常規(guī)相機(jī)的缺點

 

為了滿足極低照明下高速成像的需求追临，開發(fā)商們推出了一種有效的放大弱信號的相機(jī)，EMCCD边久。這種EMCCD 通過芯片上益增寄存器進(jìn)行信號放大蘑弊，敏感度能夠達(dá)到單光子檢測級別，同時不會像傳統(tǒng)CCD 一樣降低量子效率和空間分辨率遏治。EMCCD 的一個顯著特性是掘缭，通過芯片上專門的外延串行寄存器，在硅亞結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生碰撞電離過程中進(jìn)行增益鸵安。（Figure 4）. 由光子激發(fā)出的電荷要高于讀出噪音觅冈，這即使在高幀頻下也能實現(xiàn)，并且對于現(xiàn)在的任何CCD 都使用昵慌，包括背照芯片CCD（back-illuminated CCD）假夺。

 

 

 

EMCCD 的優(yōu)越性在于由于放大過程直接發(fā)生在CCD 的結(jié)構(gòu)內(nèi)，它要比其它的強(qiáng)化CCD（intensified CCDs）便宜一些斋攀。對于單分子成像已卷，全內(nèi)反射，針孔碟片場掃描共聚焦離子通量檢測實時3D試驗等弱信號的測定淳蔼，EMCDD 要比其它針對弱光的感光原件好很多侧蘸。另外，如果使用傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)鹉梨，EMCCD極高的敏感性可以在弱光及/或低激發(fā)強(qiáng)度下得到高信號強(qiáng)度讳癌，這樣，可以降低光毒性及熒光的光漂白存皂。

顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)

用于活細(xì)胞成像的顯微鏡的結(jié)構(gòu)必需足夠堅固晌坤，或者是鋁制的，同時艰垂，也要足夠穩(wěn)固防震泡仗。而顯微鏡外露的光學(xué)表面及聚光鏡，燈箱，物鏡轉(zhuǎn)盤等裝置必需保持潔凈裁愉，存放顯微鏡的房間要保持低濕度的無塵狀態(tài)驳辖。在活細(xì)胞成像的日常使用時，必需保證所有的光學(xué)通路及光圈在同一軸線上属缚，并應(yīng)用克勒照明体咽。存放顯微鏡的房間也有相應(yīng)要求，室內(nèi)不要安裝頂燈隧鸠，以減少直接進(jìn)入目鏡及樣品處的光線飒迅。

電子數(shù)字相機(jī)通常通過專用的接口接在顯微鏡的一個或幾個相機(jī)接口上。研究級的顯微鏡通常有多個接口同時連接幾個相機(jī)（如 Figure 1）懊玖。這對于需要使用不同手段得到*圖像效果的顯微成像是十分有用的泌弧。在顯微鏡機(jī)身內(nèi)部有一系列反光鏡，分光鏡力鹰，棱鏡分別被安置在恰當(dāng)的位置以將光信號反射到不同的相機(jī)接口及目鏡中翻框。需要注意的是，由于部分光進(jìn)目鏡而減少了進(jìn)入相機(jī)接口的光線腺首，相機(jī)成像的信噪比會降低信粮。因此，在配置顯微鏡時趁啸，應(yīng)該將若熒光照相的分光口的分光率設(shè)置為100％强缘。

物鏡負(fù)責(zé)收集由樣品發(fā)出的光線，并將其傳到顯微鏡的光學(xué)組件中不傅，因此旅掂，物鏡的選擇是至關(guān)重要的。在光路中的光學(xué)組件蛤签，如反光鏡辞友，分光鏡，聚光透鏡震肮，濾光鏡称龙，棱鏡等會嚴(yán)重的降低信噪比，所以戳晌，這種效應(yīng)必需降低鲫尊。在熒光成像時，應(yīng)當(dāng)使用高數(shù)值孔徑的物鏡沦偎，因為它能夠盡可能多的收集由樣品發(fā)射出的光線模博。數(shù)值孔徑（Numerical aperture）體現(xiàn)了其棱鏡能夠從單一點光源收集光線的能力，因此鹤仲，對于活細(xì)胞成像攘调，數(shù)值孔徑是zui重要的考慮因素剥讼。其數(shù)值標(biāo)注在物鏡筒上，大小從0.25（低放大倍數(shù)拾哈，如10x干鏡）到1.20（水鏡）及1.45（油鏡乞芳，40x - 100x范圍）不等。數(shù)值孔徑的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

Numerical Aperture （數(shù)值孔徑染痊，NA） = Refractive Index （折射率细抠，η） × Lens Acceptance Angle （鏡口角的正弦值，sin（θ））

因此组救，物鏡對光的收集能力與物鏡前透鏡及樣品間介質(zhì)的折射率有關(guān)喧丛，與鏡口角的正弦值有關(guān)。數(shù)值孔徑為物鏡分辨率數(shù)學(xué)表達(dá)式的一個因數(shù)辰车。根據(jù)瑞利判據(jù)（Rayleigh criterion缔直，一種保守的估計），分辨率等于照明光波長與一個常數(shù)（1.61）的乘積與數(shù)值孔徑的商博其。另外俩滥，數(shù)值孔徑還決定了圖像的亮度，圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比贺奠，與放大倍數(shù)的二次方成反比。所以错忱，稍微提高數(shù)值孔徑都能夠顯著地提高信號強(qiáng)度儡率。因此活細(xì)胞成像要求使用數(shù)值孔徑zui高的物鏡及高折射率的浸入物（油或水）。

如上以清，圖像的亮度與物鏡放大倍數(shù)的二次方成反比儿普，因此弱信號成像使用低倍數(shù)的物鏡。比如說掷倔，在100x數(shù)值孔徑1.4的物鏡下觀察樣品眉孩，如果這個時候信噪比成為影響圖片質(zhì)量的主要因素，那么將物鏡轉(zhuǎn)換到60x或40x勒葱，則同樣的數(shù)值孔徑下圖片的亮度會得到顯著的提高浪汪。事實上，將60x/1.4與100x/1.4的物鏡進(jìn)行對比凛虽，對同一張熒光圖像成像书吗，前者要比后者亮三倍。觀測強(qiáng)度也是衡量物鏡透光能力的一個因素礁懂。在某些試驗中女践，為了達(dá)到要求的放大率，通常要將放大與binning 處理借個起來锣石。

在多重標(biāo)記的固定細(xì)胞試驗中（有時也能是活細(xì)胞試驗）盹斟，具有色差及平場矯正的物鏡是的。然而不幸的是，復(fù)消色差物鏡和平場復(fù)消色差物鏡中相對于消色差物鏡和螢石物鏡（低度物鏡）來說焰垄，不可避免的添加了很多光學(xué)器件（透鏡）提钟。高矯正的物鏡不會生成假象，可應(yīng)用于透射光技術(shù)删舀，如相差蟀符，DIC等。然而梭狱，矯正的結(jié)果降低了光透過率拍随，這對固定細(xì)胞的成像不會有很大的影響，但是對活細(xì)胞成像來說卻不然猾瘸。闡述這種現(xiàn)象的例子是界赔，一個40x/1.4的平場復(fù)消色差的物鏡，理論上要比同類100x物鏡亮六倍牵触，但實際上淮悼，前者的亮度只有后者的四倍左右。但無論如何揽思，40x及60x的物鏡在光學(xué)分辨率極限下袜腥，仍能提供zui亮的圖片。

 

 

 

如Figure 5 所示钉汗，為就圖像分辨率及亮度方面羹令，物鏡數(shù)值孔徑的重要性。樣品為非洲綠猴的腎臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)物 （CV-1 line）损痰，用表達(dá)特異結(jié)合線粒體的EGFP 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該培養(yǎng)物福侈，在熒光顯微鏡下可以觀測到線粒體在細(xì)胞中的網(wǎng)絡(luò)分布。

Figure 5 為平場螢石物鏡下相同視野的圖片（數(shù)值孔徑1.3卢未，放大倍數(shù)由40x到100x不等）肪凛。雖然圖中的拍攝條件及矯正手段相同，但40x下的線粒體要比其它條件的亮（Figure 5（a）躏宗，圖片大小為經(jīng)調(diào)整）邦霸。相比之下，60x及100x下的圖片逐漸變暗撼腹，100x下的線粒體幾乎不可見 （Figures 5（b） & 5（c））.這樣的物鏡仍然可用瘪棱，但是必需放大檢測器的增益值，這樣一來信噪比就會降低瓦腋，圖片質(zhì)量也相應(yīng)下降窒兼。 需要注意的是，由于數(shù)值孔徑相同妙旅，從Figures 5（d）到5（f）的分辨率是一樣的军裂。

    以上的例子說明在選擇活細(xì)胞成像的物鏡時蹋烂，如果樣品標(biāo)記熒光，則不要盲目的追求放大倍數(shù)威沙。對共聚焦顯微鏡的40x或60x物鏡來說來說苹动，在成像時進(jìn)行放大后的結(jié)果和100x物鏡的成像效果相同（Figures 5（d） and 5（e））。由于具有相同的數(shù)值孔徑攘活，兩個物鏡的分辨率是一樣的蠢涝。但這種說法并不是說60x或100x 的物鏡沒有任何作用。事實上阅懦，觀察小樣品通常要使用高倍數(shù)的物鏡和二，比如寬視場顯微鏡下觀察過氧化物酶體和分泌顆粒。由于圖像大小通常與檢測器的尺寸有關(guān)耳胎，所以惯吕，光學(xué)成像zui終的放大率取決于CCD的參數(shù)（像素點大小，中間變倍等）怕午。因此废登，物鏡的選擇通常要考慮光學(xué)顯微鏡的配置，以及試驗的特殊要求郁惜。

信噪比比分辨率的影響更大的時候堡距，要選擇矯正度低的物鏡，這樣的物鏡中光學(xué)原件更少兆蕉，相對的光的透過率會顯著提高吏颖。同樣的，相差物鏡中的光學(xué)器件也會減少光的透過率恨樟。這種水平的減少在透射光成像時不會有影響，但是在熒光成像時大概會減少15 %-20％的光透率竿赂。因此仲寇，在進(jìn)行活細(xì)胞成像時，如果試驗用的熒光標(biāo)記較弱宅谁，則不能用相差物鏡购具，除非實驗步驟方面有特殊的要求。同樣的记浸，當(dāng)試驗要求將熒光圖片同DIC圖片進(jìn)行疊加時惯醇，在熒光成像前要將物鏡下方的偏光裝置拿開，因為它大概會減少30％ 的透光率裸悟。

    光路中的任何缺陷都會直接影響zui終成像的信噪比款野。對于活細(xì)胞成像來說必需消除高數(shù)值孔徑物鏡的球差。通常引起球差的因素有培養(yǎng)液及物鏡浸入物等绕时。球差是由于光沿光軸不均勻分布造成的侮增，會導(dǎo)致成像變形年铝。由于成像樣品通常較大，球差還會影響信噪比月腋。這個問題在對厚組織成像時要比薄層細(xì)胞成像時嚴(yán)重很多蟀架，由于水的折射率與培養(yǎng)基的折射率接近，通常使用水鏡來消除這個問題榆骚。另外一種方法是矯正因培養(yǎng)基或蓋玻片導(dǎo)致的折射率的改變片拍。由于折射率會受溫度影響發(fā)生變化，所以妓肢，在室溫下與在37攝氏度下的浸入物及蓋玻片厚度需要做適當(dāng)調(diào)整捌省。的物鏡可通過矯正環(huán)來消除溫度引起的折射率的改變。

 

 

 

如 Figure 6 所示职恳，為顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)（a）及數(shù)碼相機(jī)檢測系統(tǒng)（b）對活細(xì)胞成像的影響所禀。圖中樣品為鼠袋鼠腎臟的一個上皮細(xì)胞（PtK2 line），該細(xì)胞表達(dá)EGFP放钦，EGFP與H2B組蛋白結(jié)合定位于細(xì)胞核色徘。觀察方法為寬視場落射熒光。如圖操禀，左圖右下方及右圖左下方為分辨率*的兩張褂策。在活細(xì)胞顯微成像方面，光學(xué)系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑及光源的波長決定了圖像對比度與物理分辨率颓屑。在左圖中般六，隨著照明強(qiáng)度的增加，圖像中的噪音明顯減少饵卸；隨著光學(xué)分辨率的提高铲苹，細(xì)胞核中的細(xì)節(jié)變得更加清晰。

在右圖中驻奇，圖像質(zhì)量隨著灰度及空間分辨率改變镐刽。增大像素尺寸，圖像的細(xì)節(jié)變得模糊不清峰抽，圖像幾乎無法辨認(rèn)汪阱；而降低灰度，會改變圖像外形榛开，并僅呈現(xiàn)出具有高對比度的信息瘟甩。以上兩種因素共同改變圖像質(zhì)量，同樣姚锥，在活細(xì)胞成像試驗中以上因素需要根據(jù)試驗需要進(jìn)行配置询崇。

在活細(xì)胞成像試驗中還應(yīng)用了各種濾色片及反光鏡，它們的作用是調(diào)整從照明器經(jīng)顯微鏡到檢測器中光的波長凉逛。在透射光系統(tǒng)中這些增稱光學(xué)組件包括起偏器缴渊，棱鏡（DIC）赏壹，聚光鏡環(huán)，相差環(huán)等衔沼。在透射光成像系統(tǒng)中蝌借，如明視野，DIC指蚁，相差等菩佑，光的強(qiáng)度要比熒光大得多，所以凝化，為了提高信噪比稍坯，需要在光路中添加一些組件。其中首要考慮的是過濾金屬鹵素?zé)舻淖贤饧凹t外波段的光以保護(hù)樣品搓劫。紅外線產(chǎn)生的熱效應(yīng)會損害細(xì)胞活性瞧哟，并會降低紅外敏感CCD 成像的信噪比。紫外線很少出現(xiàn)在透射光源中枪向，為了阻止這些波長范圍的光勤揩，只需添加綠光片或紅光片即可。紅外及可見光濾光片都會顯著降低光強(qiáng)糠牍，所以在成像時需要增加曝光時間及增益以保證適宜的信噪比产掂。

在熒光成像中，為了保證激發(fā)光及發(fā)射光的波長在適宜的范圍內(nèi)卑我，會在光路中添加濾光片及半透半反濾光片辅及。在相對光強(qiáng)較低的熒光成像中，選擇濾光片首要考慮的是它是否能提供適宜的信噪比桌强。大多數(shù)情況下朴蛔，光會不分波長大量的通過光學(xué)組件以至于掩蓋了熒光染料發(fā)出的信號，這時帶通濾色片就顯得非常重要浴营。通常這中窄波段的濾色片會限制絕大部分光透過为毛，所以，為了得到滿意的圖片顺鸯，研究人員必需選擇適宜帶寬的濾色片。

現(xiàn)在终距，市場上有很多廠商提供特制的帶通濾色片及半透半反濾色片組合尊捞。在為活細(xì)胞成像選擇濾片組時勉瘩，為了得到好的信噪比献舍，所選的組合要zui接近熒光子的光譜性質(zhì)。例如弃舒，選擇標(biāo)準(zhǔn)的多色熒光成像FITC 濾色片組專門為進(jìn)行YFP成像時臊诊，就不需要為了提高信噪比而濾掉部分YFP 范圍內(nèi)的光（Figure 7（a））鸽粉。在這種情況下斜脂，選擇符合YFP 吸收及發(fā)射波段的帶通激發(fā)光濾色片及長通發(fā)射光濾色片會得到*的效果。

 

 

 

再舉一個兩個熒光蛋白衍生物波段的選擇實例（Figure 7）触机。圖中上部為YFP 的變種Venus 的激發(fā)及吸收光譜帚戳，它配合FITC 濾片組及寬波段發(fā)射光光譜以達(dá)到的信號收集效果。發(fā)射光濾色片的選擇與檢測器收集的信號直接相關(guān)儡首，而上述組合顯然不如寬帶通YFP 組和收集的信號多片任。 同樣的，TRITC 濾片組（Figure 7（c））在mCherry 熒光蛋白的激發(fā)波段不如Texas Red 濾片組（Figure 7（d））效率高蔬胯。另外对供，Texas Red 濾片組的發(fā)射光波段更寬，允許檢測器收集更多的信號氛濒。所以产场，在為活細(xì)胞成像選擇熒光基團(tuán)時需要配合濾片組合一起考慮，以保證得到*的激發(fā)及發(fā)射信號软动。

現(xiàn)在有更多的帶寬組合可供多色熒光標(biāo)記同時成像惧梦。另外還需要考慮的是在顯微鏡光學(xué)組件中添加中性密度濾色片來降低激發(fā)及發(fā)射強(qiáng)度——這在活細(xì)胞成像中是重要的，如同阻擋或減少紫外乌窿，紅外線的細(xì)胞光毒性悉镜。這些濾色片通常放在顯微鏡光源接口處，并可以隨時取出以增加光強(qiáng)庙炮。通過顯微鏡的光強(qiáng)及數(shù)值孔徑可以通過聚光鏡或落射照明器的孔徑光闌及視場光闌進(jìn)行調(diào)節(jié)后谱。

 

檢測器幾何形狀與光學(xué)分辨率間的匹配

由于樣品有檢測器成像，圖像的空間分辨率取決于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率种司。因為CCD 的檢測器有一列光電二極管組成刷桐，每個都有固定的尺寸，所以娶得，每個像素的幾何學(xué)特性限制了圖像的zui終的分辨率痛只。為了達(dá)到顯微鏡的分辨率，檢測器的尺寸要符合Nyquist 抽樣標(biāo)準(zhǔn)——2.5-3 pixels/Airy disk unit懊湾。舉個例子漱竖，對于光學(xué)分辨極限250 nm，圖像zui終的像素大小應(yīng)接近80-100 nm畜伐。對活細(xì)胞成像來說馍惹，信噪比要比空間分辨率更重要，所以*的成像方式為2 pixels/Airy disk玛界，這種方式不會對圖像質(zhì)量造成明顯損害万矾。降低每個像素與Airy Unit的比例會增加圖像的亮度，并且可以使用更大的CCD 光電二極管慎框，以累積更多的光電子良狈。

Figure 8（a） 中描述的是應(yīng)用高數(shù)值孔徑物鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像時Airy disk 與CCD 像素列陣的投射關(guān)系后添。列陣中每個像素大小為6μm。100x/N.A.1.4 的物鏡投影在CCD表面上的像直徑為20μm（Table 1）薪丁，因此遇西，可以達(dá)到Nyquist 抽樣標(biāo)準(zhǔn)（3.3 pixels/Airy unit）。在這樣的采樣頻率下窥突，有充足的空白可以進(jìn)行2x2 的binning 處理努溃。相對的相同數(shù)值孔徑下60x 物鏡的投影直徑為12 μm，剛好低于Nyquist 的下限阻问。另外檩翁，即使將數(shù)值孔徑降到1.3，40x 物鏡投影直徑仍只有8.4μm 族逻，需要連接放大接口才能達(dá)到Nyquist 分辨率標(biāo)準(zhǔn)景絮。光電二極管列陣的像素尺寸可大可小以匹配顯微鏡的空間分辨率，而無需添加中間變倍體崎络；或者可以配置一個特制的CCD 接口说悄，這樣的接口中包含了一系列棱鏡系統(tǒng)。

Figure 8（b） 中顯示的為2x2 binning處理的原理圖颗酷，列陣中包含16個像素合圃。曝光后，CCD 收集的光電子將進(jìn)行兩次平行遷移戏丽，然后砂猿，串行寄存器上發(fā)生兩次遷移，這樣一個像素上將收集4個像素（2x2 binning）的光電子耙屹，并將其傳輸?shù)捷敵龉?jié)點進(jìn)行放大铲醉。4x4 binning 的處理方式與此相同，在處理過程中收集列陣中16 個像素信號并在輸出前進(jìn)行放大抗俄，這樣一來可以顯著地增強(qiáng)信號脆丁，同時降低讀出噪音。如前面討論過的动雹，binning 處理是活細(xì)胞成像中一個的弱信號收集方式槽卫，這種處理可以降低對低熒光表達(dá)量細(xì)胞的毒害。

 

 

 

 

實際上胰蝠，由1.4數(shù)值孔徑的物鏡成的像歼培，zui終大小介于100-120 nm 之間。將這樣大小的信號一合適的物理尺寸轉(zhuǎn)移到CCD 光電二極管中姊氓，需要考慮物鏡的放大倍數(shù)。例如喷好，要達(dá)到60x/1.4 物鏡的zui大分辨率翔横，光電二極管不能大于6μm ——大小取決于放大倍數(shù)及分辨率读跷。然而，對100x/1.4 的物鏡來說禾唁，光電二極管zui大可至10μm效览。因此可以很明顯的看出，只有當(dāng)CCD 的配合了適當(dāng)?shù)奈镧R穗狞，數(shù)字分辨率才會與光學(xué)分辨率相匹配踱封。10μm光電二極管與100x 物鏡組合生成的圖片像素大小為100 nm；當(dāng)與60x 物鏡組合時生成的像素大小為167 nm凭衩，這時脏诈；圖片的分辨率會低一些。相比之下慌位，6μm 光電二極管與60x 的物鏡配合則是*的锯政，但是當(dāng)與100x物鏡組合時，則會取樣過度子宵。這種情況下的取樣過度會降低圖像亮度尚档，從而無法改善圖像分辨率。

從前面的討論看來彪性，似乎想要得到理想的分辨率就得為不同的物鏡配不同的CCD彩梅。實際上，這種方法一點都不實際稍记，所以巩恼，需要找到一個折衷的辦法。在有些情況下蝙斜，這個問題可以通過在CCD 與顯微鏡之間添加一個耦合器來消除物鏡放大倍數(shù)造成的影響名惩。例如，0.6x 的接口可以將100x 物鏡的投影大小降低到60x 物鏡的效果孕荠。通過售后經(jīng)銷商可以得到各種耦合器娩鹉，可放大或縮小CCD 光電二極管上投影的大小。以上的建議中需要注意的是稚伍，這些組件添加或移除相對來說非常容易弯予，不要把CCD 從顯微鏡接口處拿下來，以防灰塵或顆粒進(jìn)入顯微鏡機(jī)體內(nèi)或相機(jī)成像傳感器上个曙。清潔傳感器是件非常困難的事锈嫩，尤其是要*清除那上面的每一個灰塵及顆粒。

 

與顯微鏡光學(xué)分辨率相匹配的像素大小

 

Table 1

現(xiàn)在許多為熒光顯微鏡設(shè)計的CCD 的光電二極管大小在5-16μm 范圍內(nèi)垦搬，并可進(jìn)行binning 處理呼寸。如上討論，通過binning 處理，幾個光電二極管上的信息倍整合到一個單元中对雪，從而有效的增大像素尺寸河狐。6-8μm 大小的光電二極管可匹配60x 的物鏡，經(jīng)過2x2 binning 處理树颖，可匹配100x 物鏡若战。這中情況下，使用高透過性的物鏡效聂，可使100x 物鏡下成像更加明亮瞪澈。這樣，100x 物鏡下枷澜，bin 2 下的圖片幾乎是60x 物鏡下脓额，bin 1 圖片亮度的二倍，而分辨率近似或高于bin 1拓嗽。當(dāng)要求更高的敏感度時熏疾，使用60x 物鏡進(jìn)行2x2 binning 處理可以增加圖像亮度，這時對于活細(xì)胞成像來說尖初，分辨率上的損失在可接受范圍內(nèi)葵昂。

在一些實驗中，例如大群細(xì)胞的同時成像纯末，獲得視野內(nèi)更多的信息要比空間分辨率重要寥掐。在沒有中間變倍體的情況下，CCD 的矩形傳感器無法獲取目鏡視野內(nèi)所有的信息磷蜀，通常只有30-80% 左右召耘，大小取決于芯片尺寸。如果要獲取更大的圖片褐隆，需要添加一個具縮小功能的耦合器（如前所述）污它。通常0.6x的透鏡就可以使整個視野內(nèi)的圖片投影到芯片上，但同時會降低一些分辨率庶弃。如果要保有圖像分辨率衫贬，可以通過x-y 掃描獲取多張圖片然后用軟件進(jìn)行拼接。

光學(xué)顯微鏡上使用近紫外光源來獲得zui高分辨率歇攻。近紫外后固惯，分辨力的順序是藍(lán)，綠缴守，紅葬毫。在大多數(shù)情況下，研究人員使用金屬鹵素?zé)舢a(chǎn)生的寬光譜進(jìn)行照明屡穗，但是在活細(xì)胞成像中讥捧，照明光譜通常被濾色片控制在很窄的波段娶恕。可見光譜中部波長大約為550 nm锤楷，人眼zui敏感的綠色玫惧。Table 1 中的分辨率就是在這個波長下測定的。所以在不同波長下眯华，這些值是不同的。數(shù)值孔徑也是重要因素筋擒，如表中所列拇掺，放大倍數(shù)相同的條件下，數(shù)值孔徑越高破卜，分辨率越高赚毫。

 

總結(jié)

也許在活細(xì)胞成像中zui關(guān)鍵的就是在獲得zui高光學(xué)分辨率的同時平衡試驗中信號強(qiáng)度（降低放大倍數(shù)），分辨率（提高放大倍數(shù)）及細(xì)胞活性間的關(guān)系廷前。研究人員還必需選擇盡量少的透鏡來配合光學(xué)放大及檢測器像素尺寸筹柠。配合不同物鏡（放大倍數(shù)及數(shù)值孔徑）的各種類型的中間變倍體都可以購買得到，以滿足弱光及高分辨率試驗的要求贱甥。在選擇物鏡放大倍數(shù)時适袜，必需嚴(yán)格遵守Nyquist 分辨率標(biāo)準(zhǔn)。每個像素不得大于分辨率極限的一半舷夺；由于顯微鏡中衍射極限苦酱，工作距離通常不能小于50 nm。

活細(xì)胞成像用標(biāo)準(zhǔn)物鏡通常為10x 及40x 干鏡给猾，及40x疫萤， 60x，100x 油鏡或水鏡敢伸。經(jīng)濟(jì)的低放大倍數(shù)的干鏡通常用來進(jìn)行初步檢測扯饶，比如找到細(xì)胞的位置，因此過高不需要光學(xué)矯正池颈。然而浸潤鏡頭則需要高數(shù)值孔徑（油鏡1.3-1,4尾序，水鏡1.2），及高光透過性饶辙。由于圖片采集與視場中部蹲诀，多以高平常物鏡并沒有多大意義，而同時這樣的物鏡昂貴并且光透性比其它物鏡低弃揽。所有用于熒光成像的物鏡都需要用熒光珠檢驗其點擴(kuò)散函數(shù)管员。

無論落射熒光還是透射光（DIC 及相差），單色冷CCD 是成像的*選擇巷卵，這包括培養(yǎng)中的活細(xì)胞溅逃。在選擇相機(jī)時需要考慮的是量子效率葵稚，噪音水平（暗電流及讀出噪音），像素大猩俣А（及滿肼容量）洁席，及掃描頻率。為了減少光對樣品的損害谎躁，當(dāng)選擇高敏感度的相機(jī)值唉，即高量子效率，低噪音疮肿，大像素尺寸港赂，和低掃描頻率。因此家么，敏感度還需與分辨率（高分辨率涉功，低像素尺寸）及顯像率（高掃描頻率）之間平衡。

低掃描CCD 的幀速率通常不高略吨，因此集币，除非樣品的亮度*，在低曝光條件下信噪比會很低翠忠。這些因素都限制了CCD 在高速成像中的應(yīng)用（30幀/s）鞠苟，并是樣品成像變得令人挫敗。另外還需避免光漂白及光毒性秽之，一些產(chǎn)品在拍攝時可以在細(xì)胞活性與亮度之間取得平衡偶妖。處于以上考慮，相機(jī)應(yīng)無光閘政溃，具幀轉(zhuǎn)移或插值傳感器趾访，這樣除了低速數(shù)字信號掃描外，可以持續(xù)地在錄像速率下拍攝圖像董虱。在熒光探針亮度很低或量子產(chǎn)量很低等極弱光條件下扼鞋，如果要求高速成像，可選擇增益型或電子擴(kuò)增型CCD愤诱。